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一、概述
1.组织取材：组织块称重
2.利用液氮、研钵粉碎组织块
3.加入RIPA 缓冲液（每克组织3ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron 进一步匀浆（15,000 转/分*1 分钟）维持4℃
4.加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30 分钟
5.移入离心管4℃，约20,000g（约15,000 转）15 分钟
6.上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存
7.进行Bradford 比色法测定蛋白质浓度
8.取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液
9.沸水浴中3 分钟
10.上样
11.电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA）
12.电转膜仪转膜（100mA 40 分钟）
13.膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色
14.Westernblot 试剂盒显色
15.分析比较记录
二、Western Blotting 具体实验步骤
1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)
可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
2.电泳(Electrophoresis)
（1）SDS-PAGE 凝胶配制
（2）样品处理
在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液。例如2X 或5X 的SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液。使用5X 的SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
（3）上样与电泳
冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE 胶加样孔内即可。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准。电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad 的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V 左右。SDS-PAGE 可以采用普通的电泳仪就可以满足要求。为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE 过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90－120 分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
3.转膜(Transfer)
我们推荐在Western 实验中选用PVDF 膜。**纤维素膜(NC 膜)或PVDF 膜（二氟化树脂膜膜孔径：0.45um)也可以使用，但**纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2 条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的
SDS-PAGE 胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。
4.封闭(Blocking)
转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western 洗涤液中，漂洗1-2 分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。用微型台式真空泵吸尽洗涤液，加入Western 封闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60 分钟。对于一些背景较高的抗体，可以在4℃ 封闭过夜。
5.一抗孵育(Primary antibody incubation)
参考一抗的说明书，按照适当比例用Western 一抗稀释液稀释一抗。用微型台式真空泵吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。回收一抗。加入Western 洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10 分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10 分钟。共洗涤3 次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
6.二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
参考二抗的说明书，按照适当比例用Western 二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗，加入Western 洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10 分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10 分钟。共洗涤3 次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
7.蛋白检测(Detection of proteins)
参考相关说明书，使用BeyoECL, Western 荧光检测试剂等ECL 类试剂来检测蛋白。洗片时可以使用X 光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片。
8、膜的重复利用(Membrane recovery)
如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Western 一抗二抗去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。
三、实验注意事项
1.把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到**纤维膜上；
a. 转移缓冲液洗涤凝胶和**纤维素膜，将**纤维素膜铺在凝胶上，用5ml 移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡
b. 在凝胶/滤膜外再包一张3mm 滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡
c. 将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极
d. 将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶
e. 按照厂家所示接通电源开始电泳转移
f. 转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶
2.将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置；
3.用100ml 水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液；
4.膜置印迹缓冲液中于37℃保温1 小时；
5.室温下，用PBS-Tween 缓冲液洗涤薄膜
6.用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气；
7.袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧；
8.混合：NGS(100 微升)，印迹缓冲液中的抗体（2.5-5 毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2 小时（或4℃过夜）；
9.用总体积300ml PBS-Tween 缓冲液，分4 次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml；
10.将连接生物素的羊抗兔IgG（40 微升溶于10 毫升印迹缓冲液/100 微升 NGS）加在袋内，于室温下摇动1 小时；
11.按步骤9 洗涤；
12.加入抗生素蛋白-HRP（40 微升溶于10 毫升印迹缓冲液/100 微升 NGS），于室温下摇动；
13.Western Blot 中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于Western Blot 检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行Western Blot。实验中取胶和膜需带手套。
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